只要堅持、努力，勝利就會屬于你！“雜交瘤技術(shù)”是檢驗職稱考試需要掌握的知識，那“雜交瘤技術(shù)”的原理是什么？具體步驟又有哪些？以下是醫(yī)學(xué)教育網(wǎng)小編為大家整理的相關(guān)知識，希望有助于大家備考！祝大家考試順利，取得好成績！

雜交瘤技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。

這兩種細胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細胞（B淋巴細胞）的主要特征是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續(xù)培養(yǎng)，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即具有所謂永生性。

在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交細胞才能具有持續(xù)培養(yǎng)的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。

其原理從下列3個主要步驟闡明。

(一)細胞的選擇與融合

建立雜交瘤技術(shù)的目的是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細胞一方必須選擇經(jīng)過抗原免疫的B細胞，通常來源于免疫動物的脾細胞。

脾是B細胞聚集的重要場所，無論以何種免疫方式刺激，脾內(nèi)皆會出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增殖，只有腫瘤細胞才具備這種特性。

選擇同一體系的細胞可增加融合的成功率。多發(fā)性骨髓瘤是B細胞系惡性腫瘤，所以是理想的脾細胞融合伴侶。

使用細胞融合劑造成細胞膜一定程度的損傷，使細胞易于相互粘連而融合在一起。

最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇(PEG1 000～2 000)是最常用的細胞融合劑，一般應(yīng)用濃度為40%(W/V)。

(二)選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用

細胞融合是一個隨機的物理學(xué)過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合細胞懸液中，經(jīng)融合后細胞將以多種形式出現(xiàn)。

如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。

正常的脾細胞在培養(yǎng)基中僅存活5～7d，無需特別篩選，細胞的多聚體形式也容易死去，而未融合的瘤細胞則需進行特別的篩選去除。

細胞DNA合成一般有兩條途徑。主要途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。

另一輔助途徑是在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情況下，經(jīng)次黃嘌吟磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。

細胞融合的選擇培養(yǎng)基中有3種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。

甲氨蝶呤是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細胞利用正常途徑合成DNA，而融合所用的瘤細胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選出的HGPRT-細胞株，所以不能在該培養(yǎng)基中生長。只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能，可在HAT培養(yǎng)基中長期存活與繁殖。

(三)有限稀釋與抗原特異性選擇

在動物免疫中，應(yīng)選用高純度抗原。

一種抗原往往有多個決定簇，一個動物體在受到抗原刺激后產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答實質(zhì)是眾多B細胞群的抗體分泌，而針對目標(biāo)抗原表位的B細胞只占極少部分。

由于細胞融合是一個隨機的過程，在已經(jīng)融合的細胞中有相當(dāng)比例的無關(guān)細胞的融合體，需經(jīng)篩選去除。

篩選過程一般分為兩步進行：一是融合細胞的抗體篩選，二是在此基礎(chǔ)上進行的特異性抗體篩選。

將融合的細胞進行充分稀釋，使分配到培養(yǎng)板的每一孔中的細胞數(shù)在0至數(shù)個細胞之間(30%的孔為0才能保證每個孔中是單個細胞)，培養(yǎng)后取上清液用ELISA法選出抗體高分泌性的細胞；這一過程常被習(xí)慣地稱作克隆化。將這些陽性細胞再進行克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對目標(biāo)抗原的抗體陽性細胞株，增殖后進行凍存、體外培養(yǎng)或動物腹腔接種培養(yǎng)。

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