革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，約20～80nm。肽聚糖含量豐富，有15～50層，每層厚度1nm,約占細胞干重的50～80%。此外，尚有大量特殊組份磷壁酸(teichoic acid)。磷壁酸是由核糖醇(ribitol)或甘油(glyocerol)殘基經由磷酸二鍵互相連接而成的多聚物。磷壁酸分壁磷壁酸(wall teichoic acid)和膜磷壁酸(membrane teichoic acid)兩種，前者和細胞壁中肽聚糖的n-乙酰胞壁酸連結，膜磷壁酸又稱脂磷壁酸(lipteichoic acid)和細胞膜連結，另一端均游離于細胞壁外。磷壁酸抗原性很強，是革蘭氏陽性菌的重要表面抗原；在調節(jié)離子通過粘肽層中起作用；也可能與某些酶的活性有關；某些細菌的磷壁酸，能粘附在人類細胞表面，其作用類似菌毛，可能與致病性有關。此外，某些革蘭氏陽性菌細胞壁表面還有一些特殊的表面蛋白，如a蛋白等，都與致病有關。

革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁結構顯著不同，導致這兩類細菌在染色性、抗原性、毒性、對某些藥物的敏感性等方面的很大差異。

革蘭氏染色的結果取決于細菌細胞壁的結構即革蘭氏染色原理為：G﹢菌：細胞壁厚，肽聚糖網狀分子形成一種透性障，當乙醇脫色時，肽聚糖脫水而孔障縮小，故保留結晶紫-碘復合物在細胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯松散，乙醇脫色不能使其結構收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結晶紫-碘復合物溶出細胞壁，沙黃

復染后呈紅色。革蘭氏陽性菌細胞壁厚約20-80nm，有15-50層肽聚糖片層，含20-40%的磷壁酸。革蘭氏陰性菌細胞壁厚約10nm，僅2-3層肽聚糖，另外還有脂多糖、細菌外膜和脂蛋白。

放線菌（Actinomycete）是另一大類革蘭氏陽性菌，根據DNA中鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的含量，放線菌被稱為高G+C革蘭氏陽性菌，而厚壁菌被稱為低G+C革蘭氏陽性菌。如果細胞的第二層膜是衍生特征，這兩類革蘭氏陽性菌可能是細菌基部的分支，否則它們可能組成關系相對較近的單系群。它們被認為可能是古細菌和真核生物的祖先，因為它們都缺乏第二層膜，并且具有一些生化上的相似性，比如含有固醇類。此外，盡管恐球菌-棲熱菌(Deinococcus-Thermus)類細菌結構上類似革蘭氏陰性菌，但也可被染成革蘭氏陽性