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單克隆抗體研制最詳細步驟!!!

2012-09-20 11:45  來源:醫(yī)學教育網(wǎng)    打印 | 收藏 |
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一、單克隆抗體的概念

抗體是機體在抗原刺激下產(chǎn)生的能與該抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產(chǎn)生的,因而抗血清通常含有針對其他無關抗原的抗體和血清中其他蛋白質(zhì)成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇,所以常規(guī)抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。

即使是針對同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體,仍是由不同B細胞克隆產(chǎn)生的異質(zhì)的抗體組成。因而,常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體(polyclonal antibody),簡稱多抗。由于常規(guī)抗體的多克隆性質(zhì),加之不同批次的抗體制劑質(zhì)量差異很大,使它在免疫化學試驗等使用中帶來許多麻煩。因此,制備針對預定抗原的特異性均質(zhì)的且能保證無限量供應的抗體是免疫化學家長期夢寐以求的目標。隨著雜交瘤技術(shù)的誕生,這一目標得以實現(xiàn)。

1975年,Kohler和Milstein建立了淋巴細胞雜交瘤技術(shù),他們把用預定抗原免疫的小鼠脾細胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細胞融合,形成B細胞雜交瘤。這種雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征,既像骨髓瘤細胞一樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死,又能像脾淋巴細胞那樣合成和分泌特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細胞的單克隆系,即雜交瘤細胞系,它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體,即所謂單克隆抗體(monoclonal antibody),簡稱單抗。

與多抗相比,單抗純度高,專一性強、重復性好、且能持續(xù)地無限量供應。單抗技術(shù)的問世,不僅帶來了免疫學領域里的一次革命,而且它在生物醫(yī)學科學的各個領域獲得極廣泛的應用,促進了眾多學科的發(fā)展。

Kohler和Milstein兩人由此杰出貢獻而榮獲1984年度諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。

二、雜交瘤技術(shù)

(一)  雜交瘤技術(shù)的誕生

淋巴細胞雜交瘤技術(shù)的誕生是幾十年來免疫學在理論和技術(shù)兩方面發(fā)展的必然結(jié)果,抗體生成的克隆選擇學說、抗體基因的研究、抗體結(jié)構(gòu)與生物合成以及其多樣性產(chǎn)生機制的揭示等,為雜交瘤技術(shù)提供了必要理論基礎,同時,骨髓瘤細胞的體外培養(yǎng)、細胞融合與雜交細胞的篩選等提供了技術(shù)貯備。1975年8月7日,Kohler和Milstein在英國《自然》雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預定特異性抗體的融合細胞的持續(xù)培養(yǎng)”(Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity)的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase,HGPRT)的骨髓瘤細胞與經(jīng)綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合。融合由仙臺病毒介導,雜交細胞通過在含有次黃嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基喋呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)的培養(yǎng)基(HAT)中生長進行選擇。在融合后的細胞群體里,盡管未融合的正常脾細胞和相互融合的脾細胞是HGPRT+,但不能連續(xù)培養(yǎng),只能在培養(yǎng)基中存活幾天,而未融合的HGPRT-骨髓瘤細胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤細胞不能在HAT培養(yǎng)基中存活,只有骨髓瘤細胞與脾細胞形成的雜交瘤細胞因得到分別來自親本脾細胞的HGPRT和親本骨髓瘤細胞的連續(xù)繼代特性,而在HAT培養(yǎng)基中存活下來。實驗的結(jié)果完全像起始設計的那樣,最終得到了很多分泌抗綿羊紅細胞抗體的克隆化雜交瘤細胞系。用這些細胞系注射小鼠后能形成腫瘤,即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同質(zhì)的抗體,即單克隆抗體。

這一技術(shù)建立后不久,在融合劑和所用的骨髓瘤細胞系等方面即得到改進。最早仙臺病毒被用做融合劑,后來發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)的融合效果更好,且避免了病毒的污染問題,從而得到廣泛的應用。隨后建立的骨髓瘤細胞系如SP2/0-Ag14,X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種,所以由它們產(chǎn)生的雜交瘤細胞系,只分泌一種針對預定的抗原的抗體分子,克服了骨髓瘤細胞MOPC-21等的不足。再后來又建立了大鼠、人和雞等用于細胞融合的骨髓瘤細胞系,但其基本原理和方法是一樣的。

(二)  基本程序和方法

雜交瘤技術(shù)在具體操作上,各實驗室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的方法是作者所在實驗室采用的、實踐證明成熟的程序,該程序適合國內(nèi)大多數(shù)實驗室。

在開展雜交瘤技術(shù)制備單抗之前,培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設備:超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱(-70℃)、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機(水平轉(zhuǎn)子,4000r/min)、37℃水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。其需要的主要器械包括:100ml、50ml、25ml細胞培養(yǎng)瓶,10ml、1ml刻度吸管,試管,滴管(彎頭、直頭),平皿,燒杯,500ml、250ml、100ml鹽水瓶,青霉素小瓶,10ml、5ml、1ml注射器等,96孔、24孔細胞培養(yǎng)板,融合管(50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管),眼科剪刀,眼科鑷,血細胞計數(shù)板,可調(diào)微量加樣器(~50ul,~200ul,~1000ul),彎頭針頭,200目篩網(wǎng),小鼠固定裝置等。此外,雜交瘤細胞的篩選與檢測的儀器設備,依據(jù)檢測單抗的方法不同而各異,請參閱本節(jié)有關部分。

淋巴細胞雜交瘤技術(shù)的主要步驟包括:動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆化、凍存、單抗的鑒定等,圖6-1概括了淋巴細胞雜交瘤技術(shù)研制單抗的主要過程。

1、動物免疫

(1) 抗原制備 制備單克隆抗體的免疫抗原,從純度上說雖不要求很高,但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加,同時可以減輕篩選的工作量。因此,免疫抗原是越純越好,應根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說,抗原的來源有限,或性質(zhì)不穩(wěn)定,提純時易變性,或其免疫原性很強,或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等,免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純,但抗原中混雜物很多,特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時,則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同,也可是不同的純度,這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。

(2) 免疫動物的選擇 根據(jù)所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為,所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源于LOU/c大鼠,所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是,有時為了特殊目的而需進行種間雜交,則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定,因為染色體容易丟失。就小鼠而言,初次免疫時以8-12周齡為宜,雌性鼠較便于操作。

(3) 免疫程序的確定 免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一,其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖,以利于細胞融合形成雜交細胞,并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。因此在設計免疫程序時,應考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原。現(xiàn)用的免疫程序中多數(shù)是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射,也采用足墊、皮內(nèi)、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射,目前尤其推崇后者,因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最后一次加強免疫后第3天取脾融合為好,許多實驗室的結(jié)果表明,初次免疫和再次免疫應答反應中,取脾細胞與骨髓瘤細胞

融合,特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天,在初次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體,再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現(xiàn)的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關系,且多在血清抗體高峰之前。因此,為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞,這在最后一次加強免疫后第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道采用脾內(nèi)免疫,可提高小鼠對抗原的免疫反應性,且節(jié)省時間,一般免疫3天后即可融合。

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