「進展」急性胰腺炎的現(xiàn)代概念

    從腺泡細胞損害到全身炎癥反應(yīng)：急性胰腺炎的現(xiàn)代概念

    是什么啟動了胰腺炎？

    自100多年前胰腺自消化學說產(chǎn)生以來（1），出現(xiàn)了許多有關(guān)急性胰腺炎發(fā)病機理和病生改變的理論。當前許多的假說集中在急性胰腺炎發(fā)病早期胰腺腺泡細胞所發(fā)生的改變上（2）。眾多的研究結(jié)果證明胰蛋白酶的活化是急性胰腺炎發(fā)病早期的關(guān)鍵。Whitcomb（3，4）等的實驗結(jié)果強烈支持這一觀點。他們首次發(fā)現(xiàn)陽離子胰蛋白酶原的基因突變。并且這些突變絕大多數(shù)發(fā)生于慢性遺傳性胰腺炎病人家族中（3，4）。氨基酸互換的生物化學揭示：表現(xiàn)型胰蛋白酶更易被激活，這是當今深入研究的焦點。雖然近年最重要的發(fā)現(xiàn)之一，胰蛋白酶突變，并不能解釋未成熟消化酶是如何被激活的問題，但人們?nèi)栽谶M行對這些疾病如何擴散或限制擴散到腺泡細胞的過程進行評估。然而，在這個導致胰腺自我消化的炎癥反應(yīng)鏈中起作用的可能不止一個因素。在急性胰腺炎動物模型中已觀察到了數(shù)個腺泡細胞阻止分泌和隨后自我消化的途徑。這些機理包括未成熟腺泡的活化（5）。酶原和溶酶體的共區(qū)域化，以及隨后的溶酶體酶的重分布，細胞內(nèi)鈣的持續(xù)升高（6，7）。纖維型肌動蛋白尖端的破裂（8，9）以及轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的活化（10）。問題依然是：這些因素中到底哪一個因素是造成胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展的必要因素。

    未成熟胰蛋白酶是如何被激活的？

    胰蛋白酶的活化在急性胰腺炎發(fā)病早期的作用非常重要，這一點沒有爭論。然而，是什么激活未成熟胰蛋白酶的并不完全清楚。亞細胞定位的胰蛋白酶原的活化是當前討論的焦點。胰蛋白酶原在內(nèi)織網(wǎng)合成并轉(zhuǎn)運到高爾基體。在高爾基體此蛋白和其他消化酶一起形成顆粒并儲存。胰蛋白酶原的活化是靠水解N端10個氨基酸來完成的。劈開的區(qū)域稱為胰蛋白酶原活化肽（TAP）。從胰蛋白酶原移除的TAP通過誘導構(gòu)象改變顯露出分子活性。TAP區(qū)域不同于原胰蛋白酶原的單純的氨基酸伸展，并且用特殊的抗體可以檢測到。人們早就發(fā)現(xiàn)探測到的TAP作為人活動性急性胰腺炎活化的早期標志與臨床密切相關(guān)（11）。因此，TAP的免疫檢測已被用于檢測胰蛋白酶活動的亞細胞位點。在受到促分泌物質(zhì)超劑量的刺激時，胰蛋白酶與局部TAP位點一起發(fā)生反應(yīng)。一種共定位理論的假說認為胰蛋白酶活化發(fā)生在包含有消化酶和溶酶體酶（如組織蛋白酶的胞漿空泡小體內(nèi)。Hofbauer（12）和Otani等（13）在溶酶體標記物（GRAMP-92）和組織蛋白陽性的胞漿小泡內(nèi)檢測到了抗TAP的免疫反應(yīng)。組織蛋白酶B是一種溶酶體酶，能從胰蛋白酶原中去除TAP區(qū)域。結(jié)果組織蛋白酶B可以在特定的細胞器內(nèi)活化胰蛋白酶。對于組織蛋白酶B在試驗性胰腺炎中的重要作用的研究結(jié)果不統(tǒng)一。至少，鼠胰腺胰蛋白酶對超大量蛙皮素刺激的反應(yīng)似乎與組織蛋白酶B有關(guān)（14）。Halangk等（15）經(jīng)過仔細的研究，用基因模型進一步證實了組織蛋白酶B在腺泡中對胰蛋白酶的活化作用。他證實缺少溶酶體內(nèi)組織蛋白酶B小鼠的胰蛋白酶活性和胰腺壞死的程度均比野生小鼠明顯減低。組織蛋白酶B受破壞的小鼠并不能完全阻滯胰蛋白酶的活化，這表明還有另外的機理或其他溶酶體蛋白酶（組織蛋白酶H或S）的未成熟活化。有趣的是，在組織蛋白酶B缺少的小鼠，胰蛋白酶原活性的下降與腺泡細胞受損有關(guān)。但是，全身炎性反應(yīng)在去除組織蛋白B小鼠并不減輕。這留下了一個重要的問題：到底是否在胰腺腺泡中胰蛋白酶未成熟活化就足以啟動瀑布反應(yīng)從而導致胰腺炎�；蛘撸�是否單獨的因子在急性胰腺炎的發(fā)病中就能激活全身炎性反應(yīng)？

    血鈣持續(xù)升高，是病因還是協(xié)同因素？

    對胰腺炎早期胰蛋白酶活性與細胞內(nèi)鈣相互作用的研究越來越受到人們的重視。早期胰腺炎的研究顯示，高濃度鈣可導致腺泡細胞損害。促分泌物超大劑量刺激可導致細胞內(nèi)鈣水平持續(xù)上升。但高濃度鈣可導致胰蛋白酶原的自我活化。一些新進的研究集中在細胞內(nèi)鈣與腺泡細胞胰蛋白酶原活性之間的相互關(guān)系上。Kryger等（16）用熒光活性探針研究胰蛋白酶的活性，發(fā)現(xiàn)在超大劑量膽囊收縮素刺激下，未成熟胰蛋白酶活化起始于腺泡細胞頂端。這個活化高度地依賴于同一個亞細胞結(jié)構(gòu)內(nèi)鈣離子釋放的空間和聶temporal 的分布。其余的腺泡細胞中失活的胰蛋白酶儲存在于腺泡細胞頂端的酶原顆粒中。生理劑量促分泌物CCK顆粒的刺激是胞漿外種鈣依賴方式進行的。在這種情況下，repetitive calcium transients反復(fù)的短瞬鈣被激活，正常情況下顆粒內(nèi)的胰蛋白酶不能被這種鈣依賴方式激活。應(yīng)用超大劑量的CCK，胰蛋白酶開始在腺泡細胞頂端的一個嚴格限制的區(qū)域內(nèi)被活化。該離子的這個作用只能在峰值或平臺期Ca2+釋放時才能觀察到。但并不是一個波動的方式。同樣，作為對超大劑量蛙皮素刺激的回報，鈣離子的持續(xù)升高也可激活空泡形成。胰蛋白活化和空泡的形成能被Ca2+信號阻斷。這些研究標明在急性胰腺炎中鈣離子的持續(xù)的升高是一個重要的協(xié)同因子。鈣毒性可由于ATP耗竭或鈣依賴水解酶的過渡活化。鈣離子的病理生理作用可能并不僅限于消化酶的未成熟活化，因為高鈣濃度可以破壞細胞骨架并導致腺泡細胞的空泡形成。

    是什么誘導細胞骨架的破壞？

    急性胰腺炎最早損害之一包括導管、腺泡細胞骨架和緊密聯(lián)結(jié)結(jié)構(gòu)的破壞。在超大劑量蛙皮素刺激后不久就可觀察到來源于胰腺腺泡細胞膜的肌動蛋白的釋放。這個分解提供一個有趣的概念來解釋消化酶的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的紊亂和細胞周圍通透性的增加（如側(cè)膜分泌和活化的胰酶的向間質(zhì)和血管周圍的釋放）。微管和微絲的分解和降解可以導致蛋白分類錯誤和空泡形成。錨定肌動蛋白的一個重要的蛋白質(zhì)復(fù)合物是連接相鄰細胞的粘連連接。極性細胞相互間的接觸是由上皮細胞鈣粘連蛋白介導的。與上皮細胞鈣粘蛋白結(jié)合的跨膜位點為鈣依賴性。上皮細胞鈣粘蛋白與來自于鏈蛋白家族的蛋白結(jié)合形成復(fù)合物（17）。上皮細胞鈣粘連蛋白的細胞內(nèi)位點通過á-catenins with the p120 catenin（結(jié)合上皮鈣粘蛋白的cytoplasmatic juxtamembrane區(qū)域）的相互作用對細胞骨架起到一個固定所用。胰腺的上皮細胞鈣粘蛋白與-catenin局限于腺泡細胞。超大劑量蛙皮素刺激導致兩種蛋白在連接周圍去連接dissociation， 內(nèi)在化和降解。Leser（19）等研究錨定細胞骨架是如何被破壞的分子機制。已經(jīng)在不同的細胞成分中觀察到鏈蛋白的酪氨酸磷酸化。- or ácatenins的磷酸化可穩(wěn)定細胞骨架，p120鏈蛋白的酪氨酸磷酸化可使其與catenin/cadherin結(jié)合形成復(fù)合物對肌絲蛋白不穩(wěn)定。超大劑量蛙皮素濃度導致p120粘連結(jié)合蛋白在終端肌動蛋白未損壞之前磷酸化。P120的磷酸化在粘連結(jié)合的裂解中似乎是一個重要的步驟。在超大劑量蛙皮素刺激后2分鐘以內(nèi)發(fā)生酪氨酸磷酸化，并且可能是激動蛋白自細胞質(zhì)膜釋放的反應(yīng)，在超大劑量分泌刺激物刺激后數(shù)分鐘內(nèi)即可觀察到。

    NF-kB是保護因子還是破環(huán)因子？

    在實驗性胰腺炎中轉(zhuǎn)錄因子NF-kB被迅速激活。NF-kB是細胞因子過剩的轉(zhuǎn)錄中介并且與細胞凋亡有關(guān)（20）。早在超大劑量蛙皮素刺激后10分鐘以內(nèi)即可測到胰腺腺泡細胞中激活的NF-kB（10）。導致NF-kB活化的確切機制尚不清楚。應(yīng)用特異阻止劑的單細胞實驗證實蛋白激酶C和鈣離子是NF-kB活化的重要的因素（21）。有一些線索顯示Raf-激酶反應(yīng)和/或應(yīng)激激酶與活化NF-kB有關(guān)。然而，并未建立直接的分子聯(lián)系（22）。NF-kB的活化導致I-kB的磷酸化和降解。這個過程伴隨signalosom composed of IKK？， IKK ， and NEMO.由于I-kB的降解能在實驗性胰腺炎的腺泡中觀察到，所以很可能存在IKK的活化。在實驗性胰腺炎中NF-kB活化的結(jié)果尚不清楚。有一個假說假定胰腺腺泡NF-kB的活化是細胞因子合成的必要條件，象TNF或黏附分子（23）。粘附分子的表達和旁分泌細胞因子依次吸引免疫活性細胞到達胰腺。這個瀑布效應(yīng)最終導致強烈的炎癥反應(yīng)以及全身的炎癥反應(yīng)。相反，一些觀察反對NF-kB在急性胰腺炎中的保護作用。用N-乙酰-L-半胱氨酸和其他NF-kB或IKK的阻止劑可導致促分泌素誘導的胰腺炎減輕（10）。PAP表達可預(yù)防TNF誘導的AR42J細胞的凋亡。在這個系統(tǒng)中，抗凋亡作用依賴與NF-kB和MAP激酶的活性（24）。在實驗性胰腺炎不同的細胞中，NF-kB活化有可能具有不同的作用。在蛙皮素胰腺炎在體活化NF-kB的生化分析顯示雙向反應(yīng)：NF-kB在對CCK過度刺激反應(yīng)的很早期就已經(jīng)被激活。在大約8-12小時的高峰后活性逐漸減低。在體的基因測定發(fā)現(xiàn)第二個高峰是由炎癥細胞移動到炎癥部位造成。NF-kB在這些細胞的活化可能是腺泡細胞和免疫細胞產(chǎn)生的細胞因子的旁分泌和juxtacrine作用的結(jié)果。這些細胞因子。這個假設(shè)受到胰腺腺泡細胞在受到超量刺激時產(chǎn)生TNF，一個有力地NF-kB中介，的支持（25）。在急性胰腺炎中不同類型細胞NF-kB活化的動力學不同可能會解釋不同的發(fā)現(xiàn)，并且，更有甚者，提供治療干預(yù)的可能性。

    從局部炎癥到全身疾病

    雖然在急性胰腺炎腺泡細胞內(nèi)的變化能迅速導致亞細胞結(jié)構(gòu)的破壞。但在胰腺炎過程中，許多其他細胞也迅速被牽涉進入胰腺炎發(fā)病過程。尤其免疫細胞，如：粒細胞，淋巴細胞和巨嗜細胞，在此過程中與受損的胰腺腺泡細胞相互作用。此外不同細胞的體液因子也參與疾病的全身播散從而導致嚴重的器官功能不全，如：肺損害。從損傷的腺泡細胞釋放的細胞因子激活免疫活性細胞的炎性反應(yīng)，并從此發(fā)展成全身炎性反應(yīng)綜合征。這個放大作用的一個例子就是細胞因子經(jīng)胰腺釋放到門體循環(huán)。這些細胞因子依次活化肝Kuffer細胞。后者作為回應(yīng)增加細胞因子產(chǎn)生。這些肝細胞因子又進一步增進急性相蛋白合成并進而產(chǎn)生像肺損傷等嚴重器官功能不全。

    細胞因子作為炎癥反應(yīng)的介質(zhì)

    一個未解決的問題是胰腺炎是如何導致免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)的？在實驗性急性胰腺炎局部炎癥介質(zhì)包括單核細胞趨化蛋白（MCP-1）和TNF基因。隨后，主要通過中性粒細胞釋放IL-1，IL-6和IL-8以導致肝內(nèi)急性相蛋白合成。肝Kupffer細胞也刺激并產(chǎn)生細胞因子，已導致器官功能不全（27，26）。在急性胰腺炎中細胞因子對器官衰竭的作用的證據(jù)來源于鼠模型中受累的趨化因子受體CCR-1的破裂。刪除大鼠CCR-1與保護繼發(fā)于急性胰腺炎的肺炎癥有關(guān)。預(yù)防肺損傷與TNF水平以當時的序列的下降有關(guān)。這表明CCR-1受體的活化是全身炎癥反應(yīng)綜合征的早期表現(xiàn)（28）。有趣地，胰腺的其他細胞類型也與炎癥因子中介的的局部放大有關(guān)。在人類腺泡旁肌成纖維細胞IL-1、TNF能活化轉(zhuǎn)錄因子NF并促進化學增活素，如：MCP-1、RANTES和IL-8的表達和分泌。腺泡周圍肌成纖維細胞代表胰腺細胞的數(shù)量，這可能與相應(yīng)的胰腺星狀細胞相關(guān)（29）。趨化的細胞因子可能啟動并擴大局部炎癥反應(yīng)并吸引炎性細胞到胰腺。依據(jù)試驗顯示NF-kB在這個過程中阻止轉(zhuǎn)錄因子減少趨化表達（30）。

    免疫細胞在胰腺炎中的作用

    由體液因子介導的免疫活性細胞的趨化作用在胰腺疾病的播散中是一個重要的步驟。Rinderknecht假設(shè)嚴重胰腺炎是由于中性粒細胞的強刺激引起的（31）。中性粒細胞的浸潤與急性胰腺炎IL-1的產(chǎn)量有關(guān)。而且，在急性胰腺炎中，中性粒細胞的損耗可使肺損傷的嚴重程度減輕（32，33）。目前并不能解釋其中的機理。在促分泌素胰腺炎中細胞內(nèi)黏附分子1（ICAM-1）的上調(diào)可能與NF-kB活化相關(guān)并在實驗性胰腺炎中與噬中性粒細胞有關(guān)。超大劑量Cerulean的刺激可致胰腺腺泡細胞ICAM-1上調(diào)（34）。這些表面分子介導的中性粒細胞黏附到炎癥部位（23）。雖然在急性胰腺炎中發(fā)現(xiàn)巨嗜細胞是主要細胞，T淋巴細胞在炎癥部位也有小比例的存在。越來越多的證據(jù)顯示：活化的T淋巴細胞對于傳播急性胰腺炎是必要的。急性胰腺炎CD4/CD8比例的改變提示CD4Th淋巴細胞在疾病過程中的作用。應(yīng)用老鼠模型的遺傳概念，Demols（35）等證實CD4陽性Th淋巴細胞可改善促分泌素介導的胰腺炎。T淋巴細胞在胰腺病理中作用的重要性得到Th1型免疫反應(yīng)和人類自身免疫型胰腺炎中自身抗體增加的證實（36）。

    胰腺炎是自我防護的嗎？

    在人類急性胰腺炎具有廣泛的臨床變化，僅僅病人中的一小部分發(fā)展成為重癥胰腺炎，很早即出現(xiàn)器官功能不全和功能衰竭。關(guān)于胰腺腺泡細胞限制病情發(fā)展或阻止自我消化的內(nèi)源因子所知甚少。近年來，在試驗型胰腺炎中，熱休克蛋白（HSPs），一個可能的自我防御機制已經(jīng)引起了大家的注意。在生理條件下，HSPs或分子伴侶部分控制著折疊和新合成蛋白的裝配。這些蛋白并不僅僅與蛋白合成有關(guān)，還在各種不同的細胞應(yīng)激中防護細胞（37，38）。大鼠的超大劑量的蛙皮素刺激可致70-kD級HSPs的中等量的上調(diào)（39）。這個上調(diào)明顯不足以限制疾病抵達胰腺。在小鼠和大鼠用熱、溺水等應(yīng)激刺激誘導HSPs的表達可緩解的試驗型胰腺炎（40，41）。雖然有證據(jù)表明60kD的家族中HSPs也起著重要的作用。在急性胰腺炎中不同HSP的單獨作用并不完全清楚（42）。有一些HSPs介導的細胞保護的分子機制的線索。分子伴侶可能幫助恢復(fù)蛋白的損害和可能限制腺泡內(nèi)紊亂的錯誤路線蛋白。Bhagat 等（43）報道HSPs的過度表達尤其70-kD家族的過度表達，能防御妨礙胰島素活性的腺泡細胞損傷。這個觀察發(fā)現(xiàn)HSPs的表達與早期胰腺炎鏈級反應(yīng)有關(guān)。確切的機理仍然不清楚，部分原因是體外HSPs表達的模型不多。雖然在體內(nèi)用像溺水對于誘導高水平的HSPs是有效的，但這個途徑對于觀察HSPs上調(diào)作用是不夠全面的。最近Hietaranta （44）等的研究表明，無論在體外或體內(nèi)，溺水能有效地減少NF-kB在超大劑量蛙皮素刺激后的活性。有趣地是，溺水應(yīng)激對TNF誘導的NF-kB的活化無效。細胞內(nèi)鈣信號對于超大劑量蛙皮素刺激的反應(yīng)在提前溺水的刺激下，明顯減低，這表明溺水的一些作用可能與細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)有關(guān)（44）。