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氯霉素主要作用于細菌核糖體50S亞基，能特異性地阻止mRNA與核糖體結合。因氯霉素的結構與5‘-磷酸尿嘧啶核苷相似，可與mRNA分子中的5’-磷酸尿嘧啶核苷競爭核糖體上的作用部位，使mRNA與核糖體的結合受到抑制，從而阻止蛋白質的合成。氯霉素還可抑制轉肽酶使肽鏈不能增長，因轉肽酶可催化鍵合作用。

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