中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法細(xì)菌總數(shù)測定UDC668：576.85.07（GB7918.2～87）細(xì)菌總數(shù)系指1g或1ml化妝品中所含的活菌，數(shù)量。測定細(xì)菌總數(shù)可用來判明化妝品被細(xì)菌污染的程度，以及生產(chǎn)單位所用的原料、工具設(shè)備、工藝流程、操作者的衛(wèi)生狀況，是對化妝品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價(jià)的綜合依據(jù)。

本標(biāo)準(zhǔn)采用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法。

1方法提要

化妝品中污染的細(xì)菌種類不同，每種細(xì)菌都有它一定的生理物質(zhì)性，培養(yǎng)時(shí)對營養(yǎng)要求，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、pH值、需氧性質(zhì)等均有所不同。在實(shí)際工作中，不可能做到滿足所有菌的要求，因此所測定的結(jié)果，只包括在本方法所使用的條件下（在卵磷脂、吐溫80營養(yǎng)瓊脂上，于37℃培養(yǎng)48h）生長的一群嗜中溫的需氯及兼性厭氧的細(xì)菌總數(shù)。

2培養(yǎng)基和試劑

2.1生理鹽水：見GB7918-87《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法總則》。

2.2卵磷脂、吐溫80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

成分：蛋白胨20g

牛肉膏3g

氯化鈉5g

瓊脂15g

卵磷脂1g

吐溫807g

蒸餾水1000ml

制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫80將其他成分（除瓊脂外）加到其余蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80，混勻醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)整理，調(diào)pH值為7.1～7.2，加入瓊脂，121℃（151b）20min高壓滅菌，儲(chǔ)存于冷暗處備用。

3儀器

3.1錐形燒瓶。

3.2量筒。

3.3pH計(jì)或精密pH試紙。

3.4高壓消毒鍋。

3.5試管。

3.6滅菌平皿：直徑9cm.

3.7滅菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml.

3.8酒精燈。

3.9恒溫培養(yǎng)箱。

3.10放大鏡。

4操作步驟

4.1用滅菌吸管吸取1：10稀釋的檢樣2ml，分別注入到兩個(gè)滅菌平甲內(nèi)，每皿1ml.另取1ml注入到9ml滅菌生理鹽水試管中（注意勿使吸管接觸液面），更換一支吸管，并充分混勻，使成1：100稀釋液。吸取2ml，分別注入到兩個(gè)滅菌平皿內(nèi)，每皿1ml.如樣品含菌量高，還可再稀釋成1：1000，1：10000等，每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。

4.2將熔化并冷至45～50℃的卵磷脂、吐溫80、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿內(nèi)，每皿約15ml，另傾注一個(gè)不加樣品的滅菌空平皿，作空白對照。隨即轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待不瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h.

5菌落計(jì)數(shù)方法

先用肉眼觀察，點(diǎn)數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大5～10倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后。求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長時(shí)，該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半，面其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個(gè)平皿菌落計(jì)數(shù)后乘2，以代表全皿菌落數(shù)。

6菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法

6.1首先選取平均菌落數(shù)在30～300之間的平皿，作為菌落總數(shù)測定的范圍醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)整理。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見表中例1）。

6.2若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30～300個(gè)之間，則應(yīng)求出兩者菌落總數(shù)之比值來決定。若其比值小于或等于2應(yīng)報(bào)告其平均數(shù)，若大于2則報(bào)告其中較小的菌落數(shù)（見表中例2及例3）。

6.3若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表中例4）。

6.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均少于30個(gè)，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表中例5）。

6.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30～300個(gè)之間，其中一個(gè)稀釋度大于300個(gè)，而相鄰的另一稀釋度小于30個(gè)時(shí)，則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之（見表中例6）。

6.6若所有的稀釋度均無菌生長，報(bào)告數(shù)為每克或每毫升小于10個(gè)。

6.7菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落數(shù)在10以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之，大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個(gè)數(shù)，可用10的指數(shù)來表示（見下表報(bào)告方式欄）。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時(shí)，應(yīng)注明樣品的稀釋度。

細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方法附加說明：

本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)由“化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法”起草小組起草。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人周淑玉。

本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所負(fù)責(zé)解釋

注解：

（1）操作注意事項(xiàng)

1）盡量使菌細(xì)胞分散開，使每個(gè)菌細(xì)胞生成一個(gè)菌落，否則將會(huì)導(dǎo)致重大的技術(shù)誤差。

2）制成供試液后，應(yīng)盡快稀釋，注皿。一般稀釋后應(yīng)在1小時(shí)內(nèi)操作完畢。

3）注意抑菌現(xiàn)象。由于防腐劑未被中和，往往使平板計(jì)數(shù)結(jié)果受影響，如低稀釋時(shí)菌落少。而高釋釋度時(shí)菌落數(shù)反而增大。

4）對照試驗(yàn)?；瘖y品的稀釋液（特別是1：1O的稀釋液）常帶有化妝品顆粒，有時(shí)與菌落很難區(qū)分，為了避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，可作一個(gè)檢樣稀釋液與瓊脂混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)放到4℃環(huán)境中，以便計(jì)數(shù)檢樣菌落時(shí)用作對照。

另一種防止化妝品顆粒與菌落混淆的方法是培養(yǎng)基中加TTC

（2）細(xì)菌總數(shù)其他測定法

1）改良的細(xì)菌總數(shù)測定法一TTC法

化妝品一般由多種物質(zhì)混合而成，在進(jìn)行細(xì)菌測定前雖然經(jīng)過處理，但有時(shí)還會(huì)存在極難溶解的顆粒，特別是粉類化妝品和某些膏霜類化妝品。化妝品在前處理時(shí)有氣泡產(chǎn)生，顆粒和氣泡容易與細(xì)菌菌落相混，影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。

方法：在已熔化的卵磷脂吐-80營養(yǎng)瓊脂中，按100ml加入1m10.5%的氯化三苯四氮唑（2，3，5triphenyiterazoloride，TTC）水溶液之量加入，操作方法同標(biāo)準(zhǔn)法。培養(yǎng)后如系化妝品的顆粒，不見變化，如為細(xì)菌，則生成紅色菌落。配好的含TTC培養(yǎng)基，應(yīng)先用未加TTC的對照，以觀察其計(jì)數(shù)是否有不利影響（TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用）。

TTC溶液要放冷暗處保存，以防受熱與光照而發(fā)生分解。TTC溶液在使用前應(yīng)在水浴中煮沸半小時(shí)。

原理：無色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中，如果有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后在細(xì)菌脫氫酶的作用下，TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲*（*表示月、牙、牙和日組成的字，因無此字）（fomazan），使菌落呈現(xiàn)紅色，其反應(yīng)式見結(jié)構(gòu)圖：

2）平板表面涂布法

將培養(yǎng)基制成平板，經(jīng)干燥后，于其上滴加檢樣稀釋液0.2ml，用“L‘形玻璃棒涂布于整個(gè)平板的表面，放置片刻（約10分鐘）將平板翻轉(zhuǎn)，放入37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)，取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，然后乘以5，即為1ml稀釋樣中的菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（或每毫升）檢樣所含菌落數(shù)。