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中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法細(xì)菌總數(shù)測定UDC668:576.85.07(GB7918.2~87)細(xì)菌總數(shù)系指1g或1ml化妝品中所含的活菌,數(shù)量。測定細(xì)菌總數(shù)可用來判明化妝品被細(xì)菌污染的程度,以及生產(chǎn)單位所用的原料、工具設(shè)備、工藝流程、操作者的衛(wèi)生狀況,是對化妝品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價(jià)的綜合依據(jù)。
本標(biāo)準(zhǔn)采用標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法。
1方法提要
化妝品中污染的細(xì)菌種類不同,每種細(xì)菌都有它一定的生理物質(zhì)性,培養(yǎng)時對營養(yǎng)要求,培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH值、需氧性質(zhì)等均有所不同。在實(shí)際工作中,不可能做到滿足所有菌的要求,因此所測定的結(jié)果,只包括在本方法所使用的條件下(在卵磷脂、吐溫80營養(yǎng)瓊脂上,于37℃培養(yǎng)48h)生長的一群嗜中溫的需氯及兼性厭氧的細(xì)菌總數(shù)。
2培養(yǎng)基和試劑
2.1生理鹽水:見GB7918-87《化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法總則》。
2.2卵磷脂、吐溫80-營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基
成分:蛋白胨20g
牛肉膏3g
氯化鈉5g
瓊脂15g
卵磷脂1g
吐溫807g
蒸餾水1000ml
制法:先將卵磷脂加到少量蒸餾水中,加熱溶解,加入吐溫80將其他成分(除瓊脂外)加到其余蒸餾水中,溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80,混勻醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)整理,調(diào)pH值為7.1~7.2,加入瓊脂,121℃(151b)20min高壓滅菌,儲存于冷暗處備用。
3儀器
3.1錐形燒瓶。
3.2量筒。
3.3pH計(jì)或精密pH試紙。
3.4高壓消毒鍋。
3.5試管。
3.6滅菌平皿:直徑9cm.
3.7滅菌刻度吸管:10ml、2ml、1ml.
3.8酒精燈。
3.9恒溫培養(yǎng)箱。
3.10放大鏡。
4操作步驟
4.1用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢樣2ml,分別注入到兩個滅菌平甲內(nèi),每皿1ml.另取1ml注入到9ml滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面),更換一支吸管,并充分混勻,使成1:100稀釋液。吸取2ml,分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi),每皿1ml.如樣品含菌量高,還可再稀釋成1:1000,1:10000等,每種稀釋度應(yīng)換1支吸管。
4.2將熔化并冷至45~50℃的卵磷脂、吐溫80、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿內(nèi),每皿約15ml,另傾注一個不加樣品的滅菌空平皿,作空白對照。隨即轉(zhuǎn)動平皿,使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻,待不瓊脂凝固后,翻轉(zhuǎn)平皿,置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h.
5菌落計(jì)數(shù)方法
先用肉眼觀察,點(diǎn)數(shù)菌落數(shù),然后再用放大5~10倍的放大鏡檢查,以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后。求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點(diǎn)樣菌落蔓延生長時,該平皿不宜計(jì)數(shù)。若片狀菌落不到平皿中的一半,面其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻,則可將此半個平皿菌落計(jì)數(shù)后乘2,以代表全皿菌落數(shù)。
6菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告方法
6.1首先選取平均菌落數(shù)在30~300之間的平皿,作為菌落總數(shù)測定的范圍醫(yī)`學(xué)教育網(wǎng)整理。當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時,即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)(見表中例1)。
6.2若有兩個稀釋度,其平均菌落數(shù)均在30~300個之間,則應(yīng)求出兩者菌落總數(shù)之比值來決定。若其比值小于或等于2應(yīng)報(bào)告其平均數(shù),若大于2則報(bào)告其中較小的菌落數(shù)(見表中例2及例3)。
6.3若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表中例4)。
6.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均少于30個,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表中例5)。
6.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30~300個之間,其中一個稀釋度大于300個,而相鄰的另一稀釋度小于30個時,則以接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之(見表中例6)。
6.6若所有的稀釋度均無菌生長,報(bào)告數(shù)為每克或每毫升小于10個。
6.7菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告,菌落數(shù)在10以內(nèi)時,按實(shí)有數(shù)值報(bào)告之,大于100時,采用二位有效數(shù)字,在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值,應(yīng)以四舍五入法計(jì)算。為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù),可用10的指數(shù)來表示(見下表報(bào)告方式欄)。在報(bào)告菌落數(shù)為“不可計(jì)”時,應(yīng)注明樣品的稀釋度。
細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果及報(bào)告方法附加說明:
本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所歸口。
本標(biāo)準(zhǔn)由“化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法”起草小組起草。
本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人周淑玉。
本標(biāo)準(zhǔn)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生監(jiān)測所負(fù)責(zé)解釋
注解:
(1)操作注意事項(xiàng)
1)盡量使菌細(xì)胞分散開,使每個菌細(xì)胞生成一個菌落,否則將會導(dǎo)致重大的技術(shù)誤差。
2)制成供試液后,應(yīng)盡快稀釋,注皿。一般稀釋后應(yīng)在1小時內(nèi)操作完畢。
3)注意抑菌現(xiàn)象。由于防腐劑未被中和,往往使平板計(jì)數(shù)結(jié)果受影響,如低稀釋時菌落少。而高釋釋度時菌落數(shù)反而增大。
4)對照試驗(yàn)。化妝品的稀釋液(特別是1:1O的稀釋液)常帶有化妝品顆粒,有時與菌落很難區(qū)分,為了避免與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆,可作一個檢樣稀釋液與瓊脂混合的平板,不經(jīng)培養(yǎng)放到4℃環(huán)境中,以便計(jì)數(shù)檢樣菌落時用作對照。
另一種防止化妝品顆粒與菌落混淆的方法是培養(yǎng)基中加TTC
(2)細(xì)菌總數(shù)其他測定法
1)改良的細(xì)菌總數(shù)測定法一TTC法
化妝品一般由多種物質(zhì)混合而成,在進(jìn)行細(xì)菌測定前雖然經(jīng)過處理,但有時還會存在極難溶解的顆粒,特別是粉類化妝品和某些膏霜類化妝品?;瘖y品在前處理時有氣泡產(chǎn)生,顆粒和氣泡容易與細(xì)菌菌落相混,影響計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。
方法:在已熔化的卵磷脂吐-80營養(yǎng)瓊脂中,按100ml加入1m10.5%的氯化三苯四氮唑(2,3,5triphenyiterazoloride,TTC)水溶液之量加入,操作方法同標(biāo)準(zhǔn)法。培養(yǎng)后如系化妝品的顆粒,不見變化,如為細(xì)菌,則生成紅色菌落。配好的含TTC培養(yǎng)基,應(yīng)先用未加TTC的對照,以觀察其計(jì)數(shù)是否有不利影響(TTC在一定濃度下對革蘭氏陽性菌有抑制作用)。
TTC溶液要放冷暗處保存,以防受熱與光照而發(fā)生分解。TTC溶液在使用前應(yīng)在水浴中煮沸半小時。
原理:無色的TTC是作為受氫體加入培養(yǎng)基中,如果有細(xì)菌存在,培養(yǎng)后在細(xì)菌脫氫酶的作用下,TTC便接受氫而成為紅色的三苯基甲*(*表示月、牙、牙和日組成的字,因無此字)(fomazan),使菌落呈現(xiàn)紅色,其反應(yīng)式見結(jié)構(gòu)圖:
2)平板表面涂布法
將培養(yǎng)基制成平板,經(jīng)干燥后,于其上滴加檢樣稀釋液0.2ml,用“L‘形玻璃棒涂布于整個平板的表面,放置片刻(約10分鐘)將平板翻轉(zhuǎn),放入37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48小時,取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),然后乘以5,即為1ml稀釋樣中的菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即得每克(或每毫升)檢樣所含菌落數(shù)。